原发性高草酸尿症基因型与表型研究进展

原发性高草酸尿症(Primaryhyperoxaluria,PH)是一类常染色体隐性遗传病，是由基因突变后导致乙醛酸代谢通路异常，引起血液和尿液中草酸浓度增高进而导致肾脏结石、钙质沉积和肾功能不全甚至衰竭。随着基因诊疗技术的进步，PH患者的诊断以及高危家族成员的筛查变得越来越简单、快捷和有效；同时，随着人们对PH基因型和表型的不断认知，PH患者的治疗方式也在不断发生变化。本文将对PH基因型和表型研究以及治疗进展做一综述。

一.PH的研究概况

PH患病率小于1/1000000，但20-50%的患者可发生肾功能不全或衰竭，甚至发生移植肾结石。PH的典型表现为反复结石发作和持续的肾钙质沉着。草酸钙结晶也可沉积于视网膜、心脏、血管、骨、骨髓、血管和皮下组织等引起相应组织和器官功能异常。另外，草酸钙晶体可以阻塞肾小管，破坏细胞功能，并通过促进炎症反应和诱导氧化应激而损害附近的细胞，最终损害肾功能。PH患者通常在20-30岁时发展为终末期肾病，部分在婴幼儿及儿童期即出现肾功能衰竭。PH分为3型，即1，2和3型，分别由AGXT基因，GRHPR基因和HOGA1基因突变引起。罕见病肾结石联盟原发性高草酸尿症注册网(RareKidney Stone Consortium Primary Hyperoxaluria registry, RKSC PH registry)的信息显示PH1,PH2和PH3患者的比例各占68.4%,9.3%和11%，另有11.3%的复合诊断标准的患者未检测到三种基因的突变。随着研究的深入和病例的积累，越来越多的PH3被发现，尤其在中国等国家，PH3可能与PH1患者数接近，是PH2的两倍以上。

PH1最早于1925年被Lepoutre首次报道，直到1990年其致病基因AGXT才被确定，这个基因位于2号染色体(2p37.3)上，具有11个外显子，其编码的吡哆醛/吡哆醇依赖的肝脏特异丙氨酸-乙醛酸转氨酶(glyoxylate-aminotransferase，AGT)是一种肝脏特异性酶。AGXT基因已发现超过260种突变形式。PH1患者伴发肾钙质沉着的比例最高，钙质可在肾脏沉积导致弥漫性肾钙化。57%的PH1患者在40岁前会发展为肾功能衰竭，而88%的患者会在60岁前出现肾功能衰竭。伴有肾钙质沉着的PH1出现肾衰的风险更大，出现时间更早，Soliman等报道35.3%的PH1患者在婴幼儿期就出现了肾功能衰竭。

PH2于1968年被首次描述,1999年其致病基因GRHPR被确定，这个基因位于9号染色体(9p13.2)上，基因突变后引起乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶(glyoxylatereductase/hydroxypyruvate reductase，GR)功能异常；GRHPR有近60种突变，其中15种突变可造成酶失活丧失功能。PH2患者出现肾功能衰竭的比例相比于1型要低，46%的患者出现肾钙质沉着，疾病进展相对较慢，14%的患者在成年后会出现肾衰。

PH3是最晚被发现的，2010年Belostotsky报道了此类病例，而后其致病基因HOGA1被发现，这个基因位于10号染色体(10q24.2)上，基因突变后引起肝脏特异性线粒体酶4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶(4-hydroxy-2-oxoglutaratealdolase,HOGA)功能缺失或异常。HOGA1基因目前已发现有64种突变。HOGA功能缺失也可造成4-羟基-2-酮戊二酸蓄积抑制GR/HPR功能。PH3临床症状比1型和2型要轻，患者肾脏功能通常良好，肾钙质沉着病例罕见，仅1例患者被报道进展为终末期肾病。

二.PH基因型具有种族差异性

PH患者中，无论是1型，2型还是3型，突变热点在中西方人群中存在差异，各种类型的突变热点或热点区域均显示出一定的种族差异性。

PH1患者报道最多，56篇文献报道的AGXT突变中,66种突变见于白种人，22种见于中国人，仅有7种突变见于白人和中国人，包括p.Lys12Glnfs,p.Arg122*, p.Ser275Argfs, p.Arg333*, p.Ile340Met, p.Gly350Asp 和 p.Arg360Gln。6种在白人中最常见的突变，包括p.Gly170Arg,p.Ile244Thr, p.Phe152Ile, p.Lys12Glnfs, p.Gly190Arg 和p.Pro11Leu/Glnfs，无一种突变见于中国人。AGXT突变中绝大多数都是点突变（包括错义突变、无义突变、剪接位点突变），约占75%；剩下约25%是碱基插入或缺失突变。在欧美等国家，p.G170R, c.33dupC, and p.I244T分别见于30%，11%和6%的等位基因。而在西班牙/北非等地，p.I244T是出现最为频繁的突变类型；在日本p.S205P突变频率最高。在中国的PH1患者中，c.815_816insC是最常见的突变类型，c.33dupC在中国人群中也较为常见，其等位基因频率与c.815_816insC突变接近。

PH2患者基因型同样存在明显的种族差异，仅白种人具有c.103delG突变，位于2号外显子上的c.103delG突变占GRHPR基因突变的40%，源于北欧和美洲人群，这种移码突变可造成密码子提前终止。而c.494G＞A和78%的c.403_404+2 delAAGT变异源于南亚次大陆，相比之下c.864_ 865delTG突变仅见于日本人和中国人，占中日PH2患者等位基因的75%，c.864_865delTG突变位点靠近8号外显子的末端，这种突变可能与翻译异常相关。

PH3文献报道患者数较少，目前为止，全世界报道的患者约有100例，多数来自欧美国家，少数来自中国，突尼斯等国家。在所报道的基因突变中，绝大多数也是点突变（约占76%），PH3突变热点存在种族差异，c.700+5G>T占到西方患儿等位基因的50%以上，该基因功能缺陷多归因于该位点突变后导致的17个氨基酸插入。p.E315del突变主要见于犹太人。来自中国的病例中，无一例患者发现有c.700+5G>T，而c.834G>A和c. 834-834+1GG>TT被发现是中国PH3的最主要突变类型，c. 834-834+1可能为中国PH3的热点突变区域，这个区域的突变可能导致剪接调控因子结合序列的破坏，因此有可能为剪接突变。

三.PH基因型和表型的关系

确定PH基因型和表型的关系并不容易，除了最小等位基因需求(minorallele requiring, MiR)变异外，等位基因异质性，家族内和家族间同样基因型患者的显著表型差异，都提示环境、调节基因和表观遗传学等也可能起到一定作用。每种基因的突变类型众多，不同类型的基因型和受累等位基因差别很大。50%的PH2患者携带两种截短突变，而此类突变仅见于14.1%的PH1患者，PH3患者几乎无这种突变。GRHPR基因容易发生移码突变，包括插入、缺失、重复，或插入+重复，AGXT基因多为错义突变。PH的表型在不同亚型之间存在差异，PH1的肾钙质沉着、高草酸尿、低钙尿和低枸橼酸尿的发生率最高，PH3的临床症状出现最早，但相比于PH1和PH2，尿草酸水平低，疾病进展慢。乙醇酸和甘油酸升高多见于PH1和PH2。

PH1的临床表型最重，经过多年研究发现其基因型与表型是存在联系的。首先，婴幼儿时期发病者症状较重，进展快，发生肾衰时间早（50%婴幼儿患者在3岁时出现肾衰,2/3在10岁前出现肾衰），预后差；相比之下成年时期发病的患者症状较轻。具有G170R突变的PH1患者肾脏表现较为轻微，维生素B6治疗有效。Mandrile等将AGXT基因突变按无义突变，错义突变致脱靶(G170R)和其他错义突变几种类型，结果发现纯合无义突变、无义/错义突变、纯合错义突变、G170R/无义突变、G170R/错义突变以及G170R纯合突变患者发生终末期肾病的中位时间分别为9.9，11.5,16.9,25.1,31.2和33.9个月，具有G170R纯合突变、G170R/其他突变患者终末期肾病出现时间较晚。为了研究AGXT基因与表型的关系，将PH1患者分为基因截短突变、非截短突变和MiR（p.G41R,p.F152I p.G170R, p.I244T），结果发现具有两种MiR突变的患者症状出现更晚，发展到肾功能衰竭更慢，草酸和乙醇酸水平更低；当MiR突变被排除后，截短突变和非截短突变患者的表型无明显差异，提示非MiR突变和非截短突变的等位基因也是失活的；当把p.G170R与其他MiR突变比较时发现，仅有p.G170R纯合子临床表型最轻，这可能与AGT酶活性检验发现p.Gly170Arg突变个体的残余酶活性更高有关。

PH1患者如果发生移码突变或密码子提前终止时临床症状更重，其发病年龄较其他突变更早(24岁Vs 35岁)，c.33dupC的预后就不容乐观，该种突变的纯合子通常在婴儿时期就发病，并且大多数在1岁以前就会发展为肾衰，这是由于碱基的插入导致密码子提前终止，最终蛋白结构发生巨大变化。一般来说，对蛋白结构影响越大其对功能影响越大，表现出来的临床症状也就越重。换句话说，错义突变通常比移码突变、截短突变等临床预后要好；突变数量少的较突变数量多的要好。多个错义突变也将引起更重的表型，p.Gly350Asp纯和伴p.Leu33Met杂合者相比于p.Gly350Asp纯合者更易早发病，并更早引起肾功能衰竭。

PH1表型的多样性，除了基因型、环境、表观遗传等因素外，还与其他大量复合杂合子有关。这一现象在其他涉及多聚体蛋白的遗传疾病中都能见到，如苯丙酮尿症、精氨酸琥珀酸裂解酶缺乏症和低促性腺激素性腺功能减退等。在这些疾病中，等位基因间互补就发挥了较大作用，通过将不同突变基因产生的蛋白单体聚合在一起，最终产生的异源多聚体活性可能更强也可能更弱，还有可能不变，进而增加了其表型多样性。Montioli等研究发现G170R-Mi/S81L-Ma复合杂合子相比于S81L-Ma纯合子有更轻的表型以及更晚到达肾衰，并且细胞学实验数据与临床数据结果吻合。

PH2基因型与表型未发现存在明显的关系，这可能与PH2发病率低样本数据量不足有关。Hopp等将GRHPR基因突变类型分为截短/截短、非截短/非截短和截短/非截短突变，结果发现患者在发病年龄，肾功能衰竭时间，肾钙质沉着和尿液生化等方面均无明显差别。但是最近一项纳入101名PH2患者的回顾性研究发现，PH2患者并不像之前所认为的那样处于一个相对良性的病程，队列中超过50%的患者肾功能受到损害并且有着较高的死亡率，其首次出现症状以及确诊的中位年龄与PH1患者无明显差异（(3.2/9.0岁vs. 3.9/8.1岁），而在幼年时期发病（<1岁）的患者比率也与PH1情况相同，只是发展到终末期肾病的速度较慢。

PH3基因型和表型的关系尚无法确定，主要是因为发现的钝化突变的位点较多，但有研究发现p.Gly287Val突变患者有着更加缓和的表型，无论是纯合子还是杂合子都没有肾功能损害的情况而只是表现为普通的尿路结石的症状。除此之外，还有p.R303C，c.944_946 delAGG和c.907 C_T几种杂合突变表型较缓和的报道，但由于PH3的病例数过少，其基因型和表型关系尚有待进一步研究。

确定PH基因型和表型的直接关系并不简单，PH1在同一家族同一基因型的患者中表型也存在差异，5个具有相同AGXT基因纯合突变的兄弟肾功能衰竭出现的时间可相差20年。在PH2和PH3的患者中，相同纯合子突变也同样表现疾病进展的差异，在PH2患者GRHPR基因c.103delG纯合子患者，兄弟3人中1人在21岁时已进展为肾功能衰竭，而另外两个兄弟仅表现为偶发结石，两兄弟在56岁和53岁时肾小球滤过率分别为40ml/min和85ml/min，这些都提示生活方式，表观遗传学参与等可能影响了PH基因型和表型的关系。

四.PH基因治疗研究进展

PH目前治疗包括药物治疗，肝脏移植或肝肾联合移植等，但肝移植手术通常需要解决肝源的问题，患者也要面临手术并发症和长期口服免疫抑制剂的问题。某些基因型的PH1患者对维生素B6的治疗有效，这是PH1与PH2、PH3在治疗方面差别最大的地方。临床上观察到的对维生素B6治疗有良好反应的突变主要是p.G170R，其次是p.Phe152Ile，p.Ile244Thr，还有过少数报道c.33dupC 等截短突变也存在对维生素B6有反应的个例。p.Gly170Arg突变数量越多效果越好，该突变的杂合子在维生素B6治疗后尿液中草酸含量也会下降，但是下降的程度不如纯合子多。

随着基因和分子水平技术的进步，PH的治疗方式也在改变。对于PH1患者，乙醇酸氧化酶抑制剂可减少乙醇酸氧化，进而减少草酸的合成，但同时也会造成乙醇酸的蓄积，但动物研究显示应用乙醇酸蓄积并不造成任何副反应，即便在乙醇酸氧化酶先天缺乏的患者也未发现有任何副作用。乳酸脱氢酶是乙醛酸生成草酸的酶，理论上抑制了乳酸脱氢酶的活性可减少草酸的生成。干扰RNA(RNAinterference,RNAi)可影响乙醛酸代谢通路，研究显示RNAi可抑制乳酸脱氢酶活性，从而抑制乙醛酸向草酸转化，进而降低血液中和尿液中草酸的含量，减少结石的形成，AGT基因敲除小鼠和GR基因敲除小鼠接受RNAi治疗后尿液中草酸浓度分别降低75%和32%，目前该药物已被美国FDA批准为优先临床试验药物。基因编辑技术用于治疗PH也在研究中，Estève等采用CRISPR/Cas9技术将治疗作用的AGXT微小基因编辑到PH1人诱导多能干细胞的AAVS1位点，编辑后的干细胞分化成肝样细胞，大量来自基因编辑后干细胞所产生的肝细胞将起到原位肝移植的作用，理论上CRISPR/Cas9技术可应用于PH所有类型的治疗，当然这有待于未来进一步实验和临床研究的结果。

总之，PH是一类可造成乙醛酸代谢通路异常的单基因遗传病，基因突变造成肝脏合成酶的功能异常，主要表现为肾脏结石和钙质沉着，也可出现其他脏器损害。通过对基因型、表型及基因型和表型关系的不断认知，将有助于PH患者的早期诊疗。基因治疗如RNAi、以及CRISPR/Cas9等基因编辑技术在未来有可能成为PH的主要治疗方式。